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激光共聚焦显微镜在药剂学中的应用

更新时间:2023-03-31      点击次数:1035

激光共聚焦显微镜(K1-Fluo)是一种对样品无损害的新型成像设备,在医学,生物学,药学等方面得到了广泛的应用。激光共聚焦显微镜采用的是针孔成像的原理:在物镜的焦平面位置设置一个带有针孔的挡板,从而消除焦点以外的杂散光,从而消除了球差,并进一步消除了色差,并且通过专属的PZT 可以实现纳米精度的轴向移动,从而获得更高精度的二维光学且切片,得到分辨率更高的三维图像。


CLSM的主要优点是:高清晰度,定位准确,不会损伤样品等。由于激光共聚焦显微镜采用的是无损检测的方式,因此在进行活细胞研究时,不需要对样品进行预处理,能很好地在线样品的真实图像。目前,激光共聚焦显微镜主要应用在药剂学领域的药物经皮和粘膜吸收的研究,粘膜吸收促进剂作用机制的研究,药物的细胞摄取,穿透性能及于细胞相互作用的机制研究和载药微粒结构观察,药物成型机制及释药机制等方面的研究。

 

1.1  在药物剂型经皮和粘膜吸收方面的应用

激光共聚焦显微镜应用于脂质体经皮吸收研究

影响药物皮肤吸收的因素很多,包括分子大小,组分的亲酯性,处方组成,渗透促进剂的使用及皮肤角质层的物理状态等。Verma等研究了两种荧光标记脂质体的大小对皮肤吸收的影响,实验中将亲水性荧光复合物羧基荧光素(CF)和亲脂性荧光复合物1.1-双十八烷基-3.33.3-四甲基靛炭-喹啉蓝高氯酸盐(DiI)包裹入脂质体,应用Franz扩散池和标准皮肤洗提技术进行人体腹部皮肤的体外渗透试验,以找到脂质体局部用药的最佳粒径。通过CLSM观察脂质体渗透能力,发现Dil脂质囊泡粒径为71nm时在皮肤中荧光强度最大,CF脂质体粒径为120nm时能更好地促进皮肤的渗透。Verma等在研究以脂质体为载药系统将药物运载至皮肤的机制中,将脂质体用CF标记后,用CLSM技术可得到CF经过预定的时间到达表皮及皮肤深层的量。López-Pinto等也通过CLSM研究以米诺地尔为模型药物制备的短链醇类的磷脂脂质体及普通脂质体的透皮效果,结果发现短链醇类的磷脂脂质体的透皮数量及深度均高于普通脂质体。CLSM不用对样品进行冻结固定就能直接观察,且能穿透皮肤深层进行观察,所以被广泛地应用于亲水和亲脂标记物在皮肤中的显像及标记物强度的分析中。

 

1.2 CLSM 在微粒粘膜吸收方面的应用

近年米,胶体载药系统由于能延长药物在血液中的循坏时间而备受关注。其中将药物可降解的纳米粒用聚乙二醇(PEG)包衣是一很有前景的载药系统。与未包衣的聚乳酸(PLA)微粒相比,PEG长循环微粒被单核巨噬细胞摄取的量有所降低。PEG长循环纳米粒不仅能延长药物循环时间,Tobio等发现它还能影响PLA纳米粒与生物膜表面诸如鼻粘膜及肠粘膜的相互作用,是粘膜药的良好载体系统。为研究PLA-PEG纳米粒粒径及PEG包衣密度对鼻粘膜转运的影响,Vila等用不同分子量的PLA-PEG聚合物及不同的制备方法制备了不同粒径、不同PEG包衣密度的PLA-PEG纳米粒,将这些荧光标记的微粒鼻腔给药后,通过CLSM技术研究它们与小鼠鼻粘膜的相互作用及其转运过程。CLSM结果显示PLA-PEG纳米粒在鼻粘膜中的荧光强度远高干PLA纳米粒,表明PEG包衣对促进鼻上皮细胞转运有较大影响。同时小鼠鼻粘膜共聚焦图像结果表明PLA-PEG粒子能穿透粘膜,其穿透能力不仅受粒子粒径影响,也与PEG包衣密度有关。

CLSM在考察某种聚合物能否作为粘膜吸收的载体材料时也发挥了重要作用。Vila等通过CLSM考察了低分子量壳聚糖(CS)纳米粒能否作为一种长效鼻用疫苗的载体。他们将破伤风毒素(TT)用离子交联法包裹入低分子量CS纳米粒中,异硫氰酸荧光素牛血清白蛋白(FITC-BSA)标记后应用CLSM观察纳米粒与小鼠鼻粘膜的相互作用。结果表明CS纳米粒能穿透鼻上皮细胞,从而可以运载抗原,说明低分子量CS是一较有前景的鼻用疫苗运输载体。

 

1.3 CLSM 应用于口服疫苗肠粘膜吸收的研究

口服疫苗在很多方面优于注射剂,但疫苗在消化道易降解且较难进入胃肠道的淋巴组织,限制了口服疫苗的发展。Lubben等用CLSM技术研究了壳聚糖微粒被鼠类肠道Pever's片段摄取的情况,CLSM结果显示抗原卵白蛋白被包裹于壳聚糖微粒中,结合体内试验证明了荧光标记的壳聚糖微粒能被小鼠Pever's片段的上皮组织吸收。同时进行的其它实验表明所制备的壳聚糖微粒的释放行为适合用于口服,而Pever's片段的吸收是口服疫苗的关键过程,这些结果表明壳聚糖微粒是一很有前景的疫苗转运载体。

 

2. CLSM 应用于粘膜吸收促进剂作用机制的研究

对于甲基B一环糊精促进鼻粘膜吸收的作用机制,有人认为是通过打开鼻上皮组织紧密连接达到细胞增渗作用的。Marttin 等用透射电子显微镜研究了甲基B一环糊精对鼠鼻上皮组织紧密连接的影响,用CLSM研究了甲基B一环糊精对鼠上皮组织细胞骨架的影响,并将甲基B一环糊精的作用与吸收促进剂牛磺二氢甾酸霉素钠(STDHF)做比较。发现小鼠鼻腔给予2%田基B一环糊精后细胞骨架肌动蛋白的分布与未处理的对照组相同,说明甲基B一环糊精并不是通过对细胞骨架的作用以打开细胞的紧密连接。而注射1%STDHF的小鼠肌动蛋白分布发生了改变,鼻上皮组织也被严重破坏,通过CLSM发现STDHF会使细胞肿胀及粘液外渗,说明STDHF并不是暂时打开紧密连接,它损坏了上皮组织破坏了细胞紧密连接的完整性。因此Marttin等推断甲基B一环糊精的促吸收机理是通过提高膜流动性以打开细胞紧密连接的。可见通过CLSM的直观观察有助于研究物质的吸收机制,从而应用到基础理论的研究中。

 

3.CLSM 应用于载药微粒的结构研究

观察微球和微囊的常用方法有光学显微镜(LM)和扫描电子显微镜(SEM),但LM易受光学焦平面以外的散色光的影响而降低成像质量,对透光率差或不透光的材料制成的微球,只可观察其形态和外部结构:SEM通常需要对样品进行预处理且不能用干观察物体的内部结构,所以需要寻找一种能用于观察微粒内部结构的显微技术。Lamprecht等在1999年探讨了CLSM是否能作为观察微囊结构特征的新工具。他们应用复凝聚法制备微球,然后将油相、明胶、阿拉伯胶分别进行荧光标记。通过CLSM首先成功定位了尼罗红标记的油相;其次,通过CLSM考察了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的明胶及罗丹明B异硫氰酸(RBITC)标记的阿拉伯胶两种聚合物在囊壁材料中的分布。研究结果表明CLSM可用干评价和描述微球,观察被包封相的分布,沉积和微球表面及内部聚合物的结构,它能提供微粒的三维视图且具有很高的清晰度。

近年来,国内也开始应用CLSM技术分析载药微球的结构。谭丰苹、陆彬等以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白药物,以聚合物明胶与阿拉伯胶为成球材料制备了微球,应用CLSM将微球在不同荧光通道下成像,并将微球切割成一系列平行切面并分别成像.对微球进行三维重建和图像分析。魏农农等利用双重标记法分别对壳聚糖和磷脂进行标记,用前体脂质体方法制备氟尿嘧啶脂质体,利用CLSM观察壳聚糖包衣脂质体的形态,为进一步研究该给药系统提供依据。CLSM作为一种非破坏性观察微粒的方法,可使焦平面以外的散射光减到lowest, 提高呈像质量,并可通过使用不同的荧光标记物识别几种不同的化合物。若材料或药物可被荧光标记,CLSM就可观察微粒表面及内部的结构:通过断层扫描收集数个平行切面的数据,使观察样品的三维图像并分析成为可能。因此,采用CLSM对微粒结构进行研究将具有很好的应用前景。如Mladenovska等在研究5-氨基水杨酸壳聚糖_-藻酸盐微球的理化性质中应用CLSM分别观察了壳聚糖及藻酸盐在微球中的分布,结果显示壳聚糖均匀分布于微球外部的囊壳中,而藻酸盐则分布于微球的内部,且由于异电性相吸在壳聚糖的边缘分布较为集中,这证实了壳聚糖成功地包覆了5-氨基水杨酸微球,且聚合材料的理化性质在制备微球的过程中并未发生变化,保持了原有的荷电性及表面活性。与普通的光学显微镜及电子显微镜相比,CLSM能提供微粒的更多信息,如微粒的三维结构和囊壁聚合物的组成等,甚至能够在不破坏微球的条件下测得其包封率,但对于形状不规则及非球形的微粒还不适用。

 

4.CLSM 应用于药物成型机制和释药机制的研究

片剂是一传统的、应用广泛的剂型,而片剂的成型机理却是较复杂的。为了研究核黄素磷酸钠片的成型机制,Guo 等借助 CLSM 观察核黄素磷酸钠与两种不同型号的微晶纤维素(MCC)PH-101 PH-102 的混合物在不同压力下的显微结构,结果发现在所压制的片剂中药物形成了结晶,进而推断出药物成型机制为:在压力作用下核黄素磷酸钠所含水分溶解了药物形成一层液膜,药物发生重结晶,同时在压力作用下,由内部摩擦产生的热引起药物的熔化,当热量慢慢下降时,药物呈烧结状。通过此研究也发现 MCC 是压缩性较好的一种填充剂,在防止药物在压力下破碎起到了重要的作用。

早在 1995 Cutts 等发展了一种基于CLSM技术的新方法,可用于定量地监控控释制剂的药物释放过程,描述药物从固体制剂中的释放过程,找出合适的释药模型。Guo 等用 CLSM 研究支链淀粉水性包底衣对肠溶衣小丸抵制胃酸作用的释药机制。他们用 CLSM 研究了肠溶包衣小丸的释药过程,发现淀粉包底衣肠溶小丸比 HPMC 包底衣小丸在 0.1mol/L HCI溶液中的抗酸能力强。CLSM所得图像及核黄素磷酸钠盐(RSP)的荧光分布图与溶出结果一致:以淀粉包底衣能延缓溶出介质向小丸丸芯渗透,从而减少了肠溶小丸在 0.1 mol/L HCI溶液中的释药。经研究其释药机制是释放介质靠渗透压进入丸心溶解药物,然后药物再从包衣膜中扩散出来。除此之外,Guo .进一步用 CLSM 研究两种含有不

同辅料的包衣丸药物在包衣层的扩散。通过 CLSM 在不同厚度包衣层中药物荧光强度的定量测定,较好地展示了以支链淀粉为辅料的包衣丸无药物迁移,而以乳糖为辅料的包衣丸有较多的药物迁移,因而影响药物的释药性能。CLSM 结合数学模型用于研究药物释药过程是其在药学领域中的又一新应用,使用 CLSM不会损坏样品,可以清楚地观察药丸在水化作用下发生的变化,结合数学模型得到药物制剂相应的释放方程及释药机制。目前关于 CLSM 在这一方面应用的报道还较少。

 

展望

在只要领域,荧光显微镜已经广泛应用于研究候选药物于细胞的相互作用,而对于细胞成像,共聚焦显微镜在空间分辨率和数据质量上已经有了显著的提高。

CLSM除了用于荧光物质的成像外,还可以用反射光模式观察费荧光物质的成像,例如,可用荧光激发模式和反射模式同时观察荧光药物在某个特定细胞或组织中的穿透情况和相互作用。

CLSM 还可与其它科学技术联合应用,开辟新的研究领域。如和光谱结合可分析标记物的荧光亮度,荧光寿命,光谱特点,通过对这些参数的研究可以了解目标化合物和靶向生物分子的结合,从而可用于复杂的生化药物筛选的定量分析。从这些众多的荧光特性中,可以选择最佳的参数作为筛选药物定量分析的基础,或者借助多参数分析鉴别化合物的研究技术成果和所起到的真正的药理作用。

另外,CLSM 和多光子技术结合为动态观察和实时分析研究提供了可能。CLSM 存在激发波长有限和时间分辨率不高的缺陷。然而,随着CLSM 技术的进一步发展成熟和人们对CLSM技术认识的加强,它在药学研究领域必将得到更加广泛和深入的应用。


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