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荧光共聚焦显微镜的成像原理是怎样的?

发布时间:2022-11-23      点击次数:54
  荧光共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机和图像输出设备。那么你知道它的成像原理是怎样的吗?
  
  荧光共聚焦显微镜用一个点光源来照射标本,在焦平面上形成一个小的、定义明确的光斑。该光斑照射后发出的荧光由物镜收集,并沿原照射光路送回由双向色镜组成的分光器。分光器将荧光直接送到检测器。在光源和检测器前面都有一个针孔,分别称为照明针孔和检测针孔。两者的几何尺寸相同,约为100-200纳米;相对于焦平面上的光点,两者是共轭的,也就是说,光点可以通过一系列透镜同时聚焦于照明针孔和检测针孔。这样,来自焦平面的光可以集中在检测孔的范围内,而来自焦平面上方或下方的散射光则被阻挡在检测孔之外,无法成像。激光对样品进行逐点扫描,检测针孔后的光电倍增管也逐点获得相应光点的共焦图像,转换为数字信号传输给计算机,最后在屏幕上汇集成整个焦平面的清晰共焦图像。
 
  

荧光共聚焦显微镜
 

 

  每个焦平面图像实际上是标本的一个光学截面,它总是有一定的厚度,也被称为光学切片。由于焦点处的光强度远远大于非焦点处的光强度,而非焦点面的光被针孔过滤,所以共焦系统的景深近似为零。沿着Z轴方向扫描可以实现光学断层扫描,在待观察样品的焦点处形成一个二维的光学切片。将X-Y平面(焦平面)扫描与Z轴(光轴)扫描相结合,通过积累连续层的二维图像,用专门的计算机软件进行处理,就可以得到样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦在同一点上,使聚焦面以外的激发荧光不能进入检测针孔。
  
  荧光共聚焦显微镜的工作原理可以简单表述为:以激光为光源,在传统荧光显微镜成像的基础上增加激光扫描装置和共轭聚焦装置,通过计算机控制进行数字图像采集和处理的系统。
  
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