激光共聚焦显微镜是如何工作的？

　　激光共聚焦显微镜的工作原理如下：

　　

　　1、激光光源：

　　

　　使用一束强度稳定、单色、相干性好的激光光源，常用的激光光源包括氩离子激光器、氦氖激光器和二极管激光器等。激光光源通过准直器和聚焦镜系统聚焦成一束准直的、直径极小的激光光斑。

　　

　　2、共聚焦技术：

　　

　　采用共聚焦技术，即通过聚焦光斑和探测光斑的重叠来实现高分辨率成像。聚焦光斑从样品的一个点与探测光斑重叠之后，仅有从这个点散射回来的光能够通过探测光斑，其他来自样品其他区域的光则被阻隔掉。这样可以消除样品其他区域的散射光对图像质量的影响。

　　

　　3、扫描成像：

　　

　　激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔，因此非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。

　　

　　4、三维成像：

　　

　　通过自动移动焦点位置获取多个共焦图像，根据非连续的焦点位置（Z）和检测光强度（I），系统可以估算每个像素的光强变化曲线（I-Z曲线），并获得其峰值位置和峰值强度。由于所有像素的峰值位置与样品表面的不规则性相对应，因此可以获得样品表面的3D形貌信息。

　　

　　总之，激光共聚焦显微镜利用激光光源、共聚焦技术以及扫描成像等原理，实现了对样品的高分辨率、高对比度、非破坏性的三维成像和表面拓扑分析，在生物医学等领域具有广泛的应用价值。